rhizobium identificatie
Hoe worden de stikstoffixerende bacteriën geïdentificeerd?
Afgelopen zomer werden alle wortelknolletjes verzameld van de sojaplanten die gegroeid werden door de deelnemers van het Soja in 1000 tuinen project. In het labo van Prof. Anne Willems starten we met de volgende stap: de bacteriën uit de wortelknolletjes isoleren.
Rehydrateren van de wortelknolletjes
De ingezamelde wortelknolletjes werden gedroogd met silicagel om ze te bewaren. Hierdoor zijn ze sterk gekrompen. Voordat de wortelknolletjes gebruikt kunnen worden, moeten ze eerst gerehydrateerd worden. Dit doen we door ze overnacht in steriel water te plaatsen.
Steriliteitstest van de wortelknolletjes
De wortelknolletjes worden vervolgens aan de buitenkant gesteriliseerd omdat we geïnteresseerd zijn welke bacteriën zich in de wortelknolletjes bevinden en niet erbuiten. Het sterilisatieproces bestaat uit verschillende wasstappen met ethanol, bleekwater en steriel water. Tussendoor worden er ook fijne glassbeads gebruikt om bacteriën van het oppervlak van het wortelknolletje te 'schrapen' door middel van een vortex. Dat is een toestel dat heel hard trilt waardoor de glassbeads als een draaikolk rond de wortelknolletjes schrapen.
Om te testen of het wortelknolletje echt steriel is gieten we een paar druppels van de laatste wasstap met steriel water op een petriplaat met een groeimedium voor bacteriën. Ook rollen we het wortelknolletje op een tweede plaat om zo te testen of alle bacteriën van het oppervlak van het wortelknolletje verwijderd zijn. Deze platen plaatsen we twee tot drie dagen bij 28°C en dan wordt er gecontroleerd of er bacteriegroei zichtbaar is.
Pletten van de wortelknolletjes
Vervolgens verwijderen we alle resterende stukjes wortel die nog aan het wortelknolletje hangen en snijden we het wortelknolletje in twee. De eerste helft wordt aan het labo van Prof. Sofie Goormachtig gegeven om een analyse van het DNA op uit te voeren en het microbioom te bestuderen. Hiermee kan er achterhaald worden welke bacteriën allemaal aanwezig zijn in het wortelknolletje en in welke hoeveelheid. De andere helft wordt gebruikt om ‘wortelknolsap’ mee te maken. Dit doen we door het wortelknolletje te crushen met een steriele plastieken spatel in 50 µL steriel water. Dit is de nul-verdunning. Vervolgens verdunnen we dit sap tienmaal, twintigmaal en honderdmaal. We platen al deze verdunningen uit op petriplaten met R2A agar.
Bacteriën uit de wortelknolletjes
Sommige bacteriën groeien heel snel, in minder dan een dag tijd en anderen doen er wat langer over. Bacteriën van het genus Bradyrhizobium, waarvan we weten dat ze wortelknolletjes vormen in de wortels van soja, zijn vaak trage groeiers. Om deze bacteriën de kans te geven om te groeien laten we de platen twee weken staan bij 28°C.
Bacteriën worden beschreven
We kijken naar de bacteriekolonies met behulp van een binoculaire microscoop. Alle verschillende bacteriekolonies krijgen een nummer en worden beschreven. De kleur, glans, vorm, enz. worden genoteerd, om later te weten dat we steeds met dezelfde bacteriën werken.
Bacteriën uitvergroot
Hier kan je het resultaat zien als je door de binoculaire microscoop kijkt. Bacteriën vormen niet altijd ronde kolonies, ze kunnen ook andere vormen aannemen.
Identificatie van de bacteriën
Nadat de bacteriën zuiver zijn, zijn ze klaar om geïdentificeerd te worden. Eerst wordt er een eiwitextractie van de bacteriën gemaakt, dit doen we met behulp van twee zuren: mierenzuur en acetonitril.
Deze eiwitextractie spotten we op een metalen plaat zoals links op de foto. De spots worden vervolgens bedekt met matrix, die zal kristalliseren. De plaat wordt in het MALDI-TOF MS toestel geplaatst (zoals rechts op de foto).
Dit zal ons een spectrum geven dat we kunnen gebruiken om de bacteriën te identificeren.